产品货号：
BTN130911
中文名称：
miRNA cDNA第一链合成试剂盒
英文名称：
miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit
产品规格：
25次
发货周期：
1～3天
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本试剂盒采用在miRNA 3'末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Tag引物进行逆转录反应，最终合成miRNA对应的第一链cDNA。其反应流程如下：
- 两步式操作，先进行Poly(A)加尾，再进行逆转录反应。
- 只需要1μg的total RNA。
- 所得cDNA可用于检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。
- 与miRNA荧光定量PCR检测试剂盒兼容。
- 特异性好，独特的miRNA引物及反应体系避免了Pre-miRNA的非特异扩增。
| 成分 | 规格 |
| E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL) | 10μL |
| 10×Poly(A)聚合酶反应液 | 50μL |
| ATP溶液，1mM | 50μL |
| Oligo(dT)-Tag引物(0.5μg/μL) | 25μL |
| MMLV逆转录(含RI) | 50μL |
| 4×RT Buffer(含dNTP) | 125μL |
| RNase-free水 | 1mL |
保存：-20℃
一、对miRNA 3'末端进行加Poly(A)处理
- 在冰上预冷RNase-Free的反应管内加入以下试剂至总体积20μL。注意需要最后加入E.coli Poly(A)聚合酶。
成分 用量 自备的Total RNA(见注) 1μg 10×Poly(A)聚合酶反应液 2μL ATP溶液，1mM 2μL RNase-Free水 补水至20μL E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL) 0.4μL(2U)
注：在反应中使用的Total RNA必须含有miRNA。也可以直接使用miRNA(建议加入量为2～5μL，需根据目的miRNA的丰度决定)。 - 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60min。所得的反应液可以直接进行下游实验(注意：只能把2μL直接用于后续的RT反应，多于2μL则需要先乙醇-乙酸钠沉淀，再将加尾后的miRNA溶于水，然后再取所需量用于RT。如果不经过沉淀，带入的残留的poly(A)聚合酶反应液将会干扰RT反应)，也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。
二、对带Poly(A)尾巴的miRNA进行逆转录反应
- 按照下表设置20μL体系的RT反应：
成分 用量 Poly(A)反应产物(来于上步) 2μL RNase-Free水 10μL Oligo(dT)-Tag引物 1μL 4×RT Buffer(含dNTP) 5μL MMLV逆转录酶(含RI) 2μL - 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60min。
- 70℃保温10min终止反应。
- 合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以暂时冰上放置，立即用于后续的荧光PCR定量检测，不需要纯化。
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